Akciğer Kanseri Tedavisinde Umut Verici Sinerji

Küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC), akciğer kanserlerinin %15’ini oluştursa da oldukça ölümcüldür. Hızla büyür, agresifçe yayılır, kolayca metastaz yapar ve tedavisi zordur.

Günümüzde SCLC’nin tedavisi için platinyum, irinotekan, topotekan ve diğer bazı kemoterapötik ilaçlar mevcuttur ancak bu ilaçlara karşı direnç ve relaps yaygındır. Ayrıca SCLC için hedeflenen onaylanmış bir tedavi bulunmamaktadır.

Ekim ayında yapılan bir çalışmada turunç kabuklarından elde edilen nobiletinin SCLC için kullanımı test edilmiştir. Ayrıca nobiletin içeren bitkilerin histon deasetilazlar üzerinde aşağı regüle edici etkisi bilindiği için histon deasetilaz inhibitörü vorinostat (SAHA) ile kombine tedavisi de araştırılmıştır.

Bulgular

Kanser Hücrelerinde in-vitro Testler

Çeşitli kanser hücre kültürlerinde, tek başlarına ve kombine halde nobiletin ve SAHA’nın 24 saatlik tedavisi ile in-vitro çalışmalar yapılmıştır.

• PANC-1: insan prostat kanser hücre hattı.
• PC-3: insan pankreas kanser hücre hattı.
• A549: insan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hattı.
• Nobiletin prostat, pankreas ve küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde tek başına etkili bir inhibisyon göstermemiştir.

• H69 ve H82: Sırasıyla Çin’den ve Amerika’dan temin edilen SCLC kanser hücresi hatları.
• Nobiletin küçük hücreli akciğer kanseri hücrelerinde özellikle 30μM ve üstünde etkili inhibisyon göstermiştir.

• H82 hücrelerinde nobiletin ve SAHA’nın birlikte kullanılması ile inhibitör etkinin arttığı görülmektedir.

• H69 hücrelerinde nobiletinin tek başına daha fazla inhibitör etki gösterdiği görülmekte ancak buna değinilmeden, H82 ve H69 hücrelerinin her ikisinde de kombine halin daha etkili olduğu söylenmiştir.

Sinerjik Etki

Doz-etki grafiği ile H82 hücrelerinde nobiletin ve SAHA’nın tek başlarına ve kombine etkileri gösterilmiştir (Fig. 1K) (Fa: inhibisyon oranı). H82 hücreleri için Kombinasyon İndeks’i grafiği ile iyi bir sinerjistik etki gösterdikleri görülmüştür (Fig. 1L).

Kombine Tedavi H82 Hücrelerini Apoptozla Öldürmekte

Kombine tedavinin hücre ölümüne hangi mekanizmayla yol açtığını öğrenmek için maddeler tek başlarına ve kombine halde Hoechst 33342 Boyaması, Annexin V/PI Boyaması yöntemleri kullanılmıştır. Ve apoptotik proteinler olan PARP ve kaspaz-9 incelenmiştir.

• Hoechst boyası canlı ve cansız hücrelerin çekirdeklerine geçerek DNA ile etkileşir ve normal hücrelerde mavi; apoptotik hücrelerde nükleer kondenzasyon ve parçalanma görüldüğü için parlak mavi rengin görülmesini sağlar.
• Floresans mikroskobu ile incelendiğinde ve floresans şiddeti ölçüldüğünde nobiletin ve SAHA’nın biraz kombine tedavinin ise daha fazla nükleer kondenzasyon ve parçalanmaya yol açtığı görülmüştür.

• Annexin V Apoptoz Tespit Kiti ile yine apoptotik hücrelerin sayımı yapılmıştır.
• Annexin V/PI grafiğinde sol alt çeyrekte normal hücreler, sol üst çeyrekte nekrotik hücreler, sağ üst çeyrekte son aşama apoptotik, sağ alt çeyrekte erken aşama apoptotik hücreler görülmektedir.
• Grafikteki veriler tabloya döküldüğünde kombine tedavinin üstünlüğü tekrardan görülmektedir.

• Kombine tedavi ile apoptotik proteinler kaspaz-9 ve PARP’ın azaldığı, aktif formlarının arttığı da gözlenmiştir.
• Kaspaz-9: Apoptozun başlatılmasını sağlar. Apoptoz yolağı için kritiktir.
• PARP (poli (ADP-riboz) polimeraz): PARP ailesi DNA tamiri, genomik stabilite ve programlı hücre ölümlerinden sorumludur.
• Bu proteinlerin aktifleşmesi apoptozun gerçekleştiğini göstermektedir.

Kombine Tedavi Otofajiyle de Öldürmekte

Hücrelerde otofajiyi ölçmek için konfokal mikroskopi ile otofagozomlar ve otolizozomlar (Fig.  3A, B), MDC boyama ile otofajik veziküller ve TEM analizi ile otofajik veziküller ve otolizozomlar incelenmiştir. Otofaji spesifik inhibitörü 3-MA’nın varlığının etkisi de incelenmiştir.

• Otofagozomlar, hücre içi sitoplazmik içeriğin parçalanma sistemi olan makrootofajinin anahtar bileşenidir. Lizozomlarla birleşerek otolizozomları oluştururlar.
• Görüntüde yeşil renkli olarak otofagozomlar, kırmızı olarak otofagozomlar ve otolizozomlar görülmektedir. Bu iki görüntü birleştirildiğinde iki rengin birleşip sarı görülen kısımlar otofagozomları göstermekte ve kırmızı kalan kısımlar yalnızca otolizozomları göstermektedir. Mavi renk de hücre çekirdeklerini göstermektedir.
• En yoğun sarı renk 30 μM nobiletinde gözlendiği ve bu grupta otofajik akının (flux) daha yüksek olduğu yani otofajik yıkımın daha hızlı gerçekleştiği belirtilmiştir.

• TEM (Geçimli elektron mikroskobu) analizi ile mitokondri ve hücre çekirdeği incelenmiştir.
• Kombine tedavide otofajik veziküller ve otofagozomların sayısında büyük oranda artış görülmüştür.

In-vivo Testler

Nobiletin ve SAHA’nın antitümör etkileri H82 hücrelerinin ksenotransplantasyonuyla gösterilmiştir. 20 günlük tedavi ilgili bileşik po olarak günde bir defa verilerek yapılmıştır.

Kombine tedavi ile tümör büyümesi iyi bir şekilde inhibe edilebilmiştir.

• Tümör ağırlığında ve hacminde azalış gözlenmiştir.
• Kombinasyon tedavi ile farelerin daha az kilo kaybettikleri görülmüştür.

• p62: p62 seviyesi normal koşullarda apoptoz süresince düşer.
• Light chain 3II (LC3II): Otofagozom oluşumunun indikatörüdür.
• P62 ve LC3II proteinlerinin western bloat analizi ile incelenmesi in-vivo olarak da apoptoz ve otofajinin arttığını göstermiştir.

Nobiletinin Proteinlere Afinitesi

AutoDock Vinal1.2.2 yazılımı ile moleküler kenetlenme simüle edilmiştir ve proteinlere bağlanma enerjileri hesaplanmıştır. Bu değerler daha sonra daha önce araştırılmış bilinir diğer inhibitörlerin verileri RCSB Protein Data Bank’den alınarak kıyaslanmıştır.

• Nobiletinin BCL-2, BCL-XL ve MCL-1 proteinlerine yüksek afinite gösterdiği gözlemlenmiştir.
• BCL-2 inhibitörü ABT263 (A), BCL-XL inhibitörü 3CQ (C), MCL-1 inhibitörü 6AK (E)’nin ve nobiletinin (B, D ve F) moleküler kenetlenmesi görsellendirilmiştir (Fig. 5).
• Nobiletinin tüm kenetlenme modellerinde bağlanma afinitesi –5 kcal/mol’den düşük olduğu görülmüştür. Bu da hedef proteinlere stabil bir şekilde bağlandığını gösterir.

• Nobiletinin bağlanma durumundaki stabiliteyi onaylamak için sırasıyla BCL-2, BCL-XL ve MCL-1 ile oluşturduğu komplekslerin serbest enerjileri incelenmiştir (Fig. 5I-J).
• Nobiletinin proteinler ile kompleks halinde de dinamik olarak stabil olduğu görülmüştür.

SRP Sensorgramı

SRP sensorgramı ile BCL-2, BCL-XL ve MCL-1 proteinlerinin, nobiletin ve inhibitörlerinin doza bağlı olarak nasıl bağlandığı incelenmiştir.

• Nobiletinin proteinlere direkt bağlanıp bağlanmadığını araştırmak için SRP sensorgramı ile incelenmiştir ve direkt olarak bağlandığı görülmüştür.
• Doza bağlı olarak bağlanma oranının da arttığı gözlenmiştir.
• Diğer ligandlarla karşılaştırıldığında nobiletinin proteinlere daha düşük afinite gösterdiği görülmüştür.

PI3K-AKT-mTOR Sinyal Yolağı Aktivasyonunun İnhibisyonu

Nobiletinin SAHA ile hangi mekanizma ile sinerjik etki oluşturduğunu araştırmak için PI3K-AKT-mTOR sinyal yolağı incelenmiştir. Bu yolağı aktive etmek için İnsülin-benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1) kullanılmıştır.

Nobiletin, SAHA ve kombine tedavi; proteinlerin fosforilize hali olan p-PI3K, p-AKT ve p-mTOR seviyelerini düşürmüştür.

• PI3K-AKT-mTOR sinyal yolağını aktive eden IGF-1’in nobiletin ve SAHA’nın inhibitör etkisini azalttığı görülmüştür.
• Aynı zamanda IGF-1 eklendikten sonra p-mTOR/mTOR oranının tedavi ile azaltılamadığı gözlenmiştir.
• Bu bulgular nobiletin ve SAHA’nın PI3K-AKT-mTOR yolağı üzerinden etki ettiğini göstermiştir.

• Sinerjistik etkinin mekanizmasını açıklamak için nobiletin ve SAHA’nın BCL-2 protein ailesindeki önemli proteinlerle etkileşimi incelenmiştir.
• Kombine tedavinin antiapoptotik proteinler BCL-2, BCL-XL ve MCL-1 seviyesinde azalmaya; proapoptik protein BAX seviyesinde artışa yol açtığı görülmüştür.
• BAX: Mitokondri dış zarındaki voltaj kapılarını açarak sitokrom c salınmasını sağlar. Sitokrom C apoptozda görev alır.

BCL-2-Beclin-1 Kompleksi ve Histon Proteinleri Üzerindeki Etkisi

Western bloat yöntemi ile Beclin-1 proteini ve histon proteinleri H3K9ac ve H3K27ac seviyeleri incelenmiştir.

• Beclin 1 proteini otofajinin başlaması ve otofagozomların oluşması için önemli bir proteindir.
• BCL-2 ile kompleks oluşturur ve bu kompleks otofajiyi inhibe eder.
• Ko-İmmünopartisipasyon ile kombine tedavinin BCL-2 ve Beclin 1’in bağlanma oranını düşürdüğü görülmüştür.
• Bu da tedavinin BCL-2-Beclin 1 kompleksini ayırdığını ve böylece otofajiyi aktive ettiğini göstermiştir.

• Sinerjinin histon asetilasyon aktivesinde de etkili olduğunu doğrulamak için H3K9ac ve H3K27ac seviyeleri incelenmiştir ve tedavinin bu proteinleri artırdığı görülmüştür.
• Kombine tedavi ayrıca apoptozu gösteren serbest BIM ve BID seviyelerinde de artışa neden olmuştur. Bu sonuçlar BIM- ve BID-kaynaklı apoptozu artırdığını göstermiştir.
• Kombine tedavi BH3-only proteinlerin ekspresyonunda ve histonların asetilasyonunda artışa neden olmuştur. Böylece kromatinler gevşemiştir.

Sonuç

Küçük hücreli akciğer kanseri, genellikle geç bir aşamada teşhis edilmesi, hızlı bir şekilde yayılması ve standart kemoterapi ve radyoterapiye kolayca direnç geliştirmesi nedeniyle tedavisi zor bir kanser türüdür. Bu nedenle, alternatif ajanlar ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi gerekmektedir. Yapılan çalışmada, turunç kabuklarından elde edilen nobiletin ve histon deasetilaz inhibitörü vorinostat (SAHA) kombinasyonunun antitümör etkileri değerlendirilmiştir. Nobiletin’in BH3 mimetik olarak işlev gördüğü ve BCL-2, BCL-XL ve MCL-1 gibi antiapoptotik proteinlere yüksek afinitesi olduğu tespit edilmiştir.

SCLC’nin önemli karakteristiklerinden olan histon modifikasyonu ve nobiletinin histon deasetilazları aşağı regüle edici etkisi bilindiği için kanser tedavisi için araştırılan bir histon deasetilaz inhibitörü olan SAHA ile kombinasyonunu düşündürmüş ve bu iki bileşiğin kombine tedavisi de araştırılmıştır. Kombine tedavi, SCLC hücrelerinde sinerjistik bir etki göstermiş, apoptozu artırmış ve otofaji yoluyla hücre ölümüne katkıda bulunmuştur. In-vivo testlerde, farelerde yapılan ksenograft deneyleri, nobiletin ve SAHA kombinasyonunun tümör büyümesini etkili bir şekilde inhibe ettiğini ve apoptozu artırdığını göstermiştir. Sonuç olarak, bu bulgular, nobiletin ve SAHA kombinasyonunun SCLC tedavisinde potansiyel bir strateji olabileceğini ve bu kombinasyonun antitümör etkilerini sinerjik olarak artırabileceğini öne sürmektedir.